微流控生物反應(yīng)器內(nèi)的真菌代謝物篩選

作為無柄生物，植物不能輕易通過搬遷來規(guī)避壓力源。為了評估所經(jīng)歷的非生物和生物脅迫的質(zhì)量和數(shù)量，植物已經(jīng)進化出復(fù)雜的信號通路。通常，屬于潛在病原體的分子是在植物質(zhì)膜的水平上被識別出來的。識別后，信號從細胞外部傳遞到細胞中，最終誘導(dǎo)防御反應(yīng)（如果可能的話）。在病原體觸發(fā)免疫 （PTI） 中，一種基礎(chǔ)防御反應(yīng)，信號通常在二級信使 Ca 的幫助下傳遞2+.細胞外間隙含有相對高濃度的 Ca2+，尤其是與細胞質(zhì)中的濃度并列時。為了對病原體的存在做出反應(yīng)，Ca2+離子被轉(zhuǎn)運到細胞中，在轉(zhuǎn)錄因子的幫助下改變細胞的行為。這個 Ca 的導(dǎo)入2+與 H 跨質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運一起發(fā)生。質(zhì)子的轉(zhuǎn)運導(dǎo)致細胞外 pH 值的變化，這很容易量化。pH 值變化是評估植物是否發(fā)生 PTI 反應(yīng)的常用讀數(shù)。

為了快速連續(xù)篩選多種真菌代謝物的免疫活性，需要一個簡單可靠的系統(tǒng)來測量微流體生物反應(yīng)器 （MBR） 中的 pH 值變化，該系統(tǒng)由 KIT 微結(jié)構(gòu)技術(shù)研究所 （IMT） 與 KIT 植物研究所合作開發(fā)。因此，設(shè)計了一個從 PreSens pH-1 SMA HP5 到 MBR 中相應(yīng)傳感器點 SP-HP5的可伸縮但可密封的連接器，并在機械和生物實驗中進行了檢查。MBR 是一種用于培養(yǎng)植物細胞的雙室生物反應(yīng)器（見圖 1A）。透膜將培養(yǎng)室和營養(yǎng)流室隔開。它最初是由 IMT 的 Tim Finkbeiner 設(shè)計的，然后進一步發(fā)展。細胞可以通過橢圓形腔室兩端的兩個開口帶入培養(yǎng)室。開口配有 M5 螺紋，以便用合適的螺釘密封。MBR 可以通過單向流連接到更多的 MBR。因此，留在培養(yǎng)室中的細胞持續(xù)獲得來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，同時它們自身的代謝產(chǎn)物被運輸?shù)较乱粋€ MBR 并帶走廢物。基本原理是剖析細胞間通訊通路，通過每個 MBR 培養(yǎng)一種細胞來獲取有關(guān)所涉及的過程和反應(yīng)的信息。在 MBR 的培養(yǎng)室中培養(yǎng) Nicotiana tabacum 的 BY2 系細胞時，通過 pH-1 SMA HP5 定量 pH 值。可以將要評估免疫活性的物質(zhì)添加到供應(yīng)給細胞的培養(yǎng)基中。如果可以觀察到 pH 值的增加，則可以將其解釋為目標物質(zhì)免疫活性的第一個跡象。

圖 1：微流控生物反應(yīng)器 （MBR）：A） MBR 的頂視圖和側(cè)視圖示意圖。它由兩個腔室組成，由半透膜隔開，僅允許介質(zhì)和溶劑通過。B） MBR 和傳感器的設(shè)置：傳感器點 SP-HP5 通過一個連接器安裝，該連接器擰入培養(yǎng)室兩個螺紋開口的右側(cè)（在這種情況下，第二個開口覆蓋有 851 型 3M 聚酯膠帶）。傳感器點通過玻璃纖維連接到測量設(shè)備 pH-1 SMA HP5 上。

結(jié)論

從我們的實驗結(jié)果和不同的設(shè)計中，我們得出結(jié)論，通過不同連接器設(shè)計的透光率似乎并沒有顯著影響測量。然而，與通過玻璃燒杯進行的參考測量相比，聚合物連接器測得的 pH 值似乎發(fā)生了變化。由于玻璃是傳感器指南中規(guī)定的適當(dāng)反應(yīng)器材料，因此可能需要進行特殊校準來應(yīng)對玻璃中的光折射，這會導(dǎo)致使用聚合物時測量值發(fā)生變化。如果這種變化可以得到驗證 - 可能通過更多和不同的設(shè)置測試 - 并且考慮到 pH-1 SMA HP5 傳感器的相應(yīng)位置將適合測量我們 MBR 中的 pH 值。

在之前的實驗中，我們通過使用使用電極的臺式 pH 計測量 pH 值，證實了 25 μg/mL 殼聚糖會導(dǎo)致 BY2 細胞中細胞外 pH 值升高。使用相同的處理，這項工作旨在證明 MBR 和 pH-1 SMA HP5 系統(tǒng)的組合可用于觀察與免疫反應(yīng)相關(guān)的細胞外 pH 值增加。開始處理后，15 分鐘后觀察到 pH 值顯著升高。這種延遲可以通過處理后的 MS 需要泵入 MBR 的時間來解釋。觀察到的 pH 值變化表明該方法可用于篩選植物細胞上物質(zhì)的免疫活性。通過使用多個通道和傳感器點，將有可能建立高通量 篩選方法。此外，我們研究了由于腔室的橢圓形，MBR 培養(yǎng)室中營養(yǎng)梯度的發(fā)展。關(guān)于此評估，在更大區(qū)域（例如，使用 VisiSens 系統(tǒng)）中分析 pH 值將很有趣。然而，傳感器箔必須打孔，營養(yǎng)流才能到達培養(yǎng)室，并且必須建立傳感器箔的安裝過程。